A investigação pré-clínica do fenótipo do câncer, agressividade e resistência aos antineoplásicos é geralmente realizada em modelos in vitro de cultura de células tumorais em duas dimensões. Porém, esse modelo apresenta limitações, como baixa interação celular com a matriz extracelular e entre células de diferentes linhagens e não equivalência de efeito de antineoplásicos com modelos in vivo. Assim, os modelos de cultura 3D foram desenvolvidos para promover melhor simulação das condições in vivo de interações celulares e expressões fenotípicas. Assim, os objetivos deste estudo foram desenvolver um modelo de cultura 3D (esferoides) para as linhagens celulares de carcinoma de pulmão de não-pequenas células NCI-H460 e de carcinoma colorretal HT-29 e avaliar o efeito da quimioterapia neste modelo. Primeiramente foram realizados testes para padronizar o protocolo de cultivo 3D. A seguir a linhagem NCI-H460 foi exposta ao tratamento com cisplatina e a linhagem HT-29 ao quimioterápico 5-Fluorouracil. A análise foi realizada por mensuração do diâmetro dos esferoides antes do tratamento, 48 h após o tratamento e depois a cada 3 dias, até os esferoides se desintegrarem. Observamos que: a densidade ideal a ser utilizada para este é 10x10⁴ células; o tempo para a formação dos esferoides é entre 5 e 7 dias; a durabilidade dos esferoides é de 15 a 17 dias; os esferoides não tratados apresentaram um aumento significativo de diâmetro em relação aos tratados. Com isso, concluímos que o método de formação de esferoides proposto por esse trabalho permite o uso das linhagens NCI-H460 e HT-29 para estudos in vitro a fim de contribuir para o conhecimento em relação a biologia do tumor e eficácia de antineoplásicos.