O câncer de cólon é a terceira neoplasia mais prevalente no mundo, e a quarta causa de morte por câncer. Neste sentido, muitos estudos têm sido realizados na busca de novas formas terapêuticas para esta patologia. Neste estudo nós avaliamos a capacidade da gemcitabina em sensibilizar linhagens celulares de carcinoma de cólon humano e seu efeito sobre o ciclo celular. Para isso, as linhagens celulares de carcinoma de cólon humano SW-620, HT-29 e SNU-C4 foram expostas à gemcitabina. Foi avaliado o efeito citotóxico pelos ensaios de sulforodamina B e distribuição das células no ciclo celular. As linhagens Sw-620 e HT-29 se mostraram mais resistentes (IC₅₀ de 13µM e 10µM, respectivamente) em comparação à linhagem SNU-C4 (3,5 µM). A fim de determinar a inibição da proliferação celular nas linhagens celulares, avaliamos a distribuição do ciclo celular após 72 h de exposição ao tratamento. Com isso, observamos uma parada expressiva na fase S do ciclo celular em linhagens expostas a Gemcitabina, quando comparadas a células não tratadas. Em síntese nossos achados demonstram que a gemcitabina possui maior efeito na linhagem celular SNU-C4, em relação a outras linhagens celulares derivados de câncer de cólon humano que estudamos e sugere que a gemcitabina esteja associada a capacidade de sincronizar as células na fase S do ciclo celular