O queijo colonial é produzido com leite não pasteurizado e portanto deve seguir normas rigorosas de higiene durante a fabricação, visando evitar o crescimento de micro-organismos patogênicos e deteriorantes. Os principais contaminantes microbianos em queijos são bactérias como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Salmonella sp. O presente estudo teve como objetivo realizar uma análise da qualidade microbiológica de amostras de queijos coloniais provenientes de diferentes fábricas de produção de queijo colonial localizadas em diferentes mesorregiões do estado do Rio Grande do Sul. Um total de 130 amostras foram coletadas e submetidas para avaliação microbiológica. Os resultados mostraram ausência de Salmonella sp em todas as amostras. Coliformes 45°C e Staphylococcus coagulase positiva foram considerados positivos em 29,6% (1,2 x 10⁵ UFC g-¹) e 40,0% (6,0 x 10⁴ UFC g-¹) das amostras totais, respectivamente. Especificamente Listeria monocytogenes foi detectada em três amostras (2,3%) sendo confirmada por PCR. A análise estatística revelou que não houve correlação significativa na comparação da frequência de micro-organismos e o processo de produção, as mesorregiões de origem e o tempo de maturação. Entretanto, a ocorrência de casos de coliformes termotolerantes e estafilococos coagulase positivos acima do nível tolerado e a detecção de três casos positivos de Listeria monocytogenes demonstram a importância de estabelecer critérios para avaliação microbiológica de queijos coloniais e valorização deste produto no Rio Grande do Sul.