As salmoneloses são doenças normalmente entéricas causadas pelo consumo de alimentos contaminados por Salmonella. Essa bactéria é classificada em mais de 2.600 sorotipos que necessitam ser identificados para fins diagnósticos e epidemiológicos. No entanto, os procedimentos laboratoriais de sorotipagem são trabalhosos e demorados. Esse estudo objetivou estabelecer métodos de análise de DNA para identificar sorotipos de Salmonella. Os procedimentos experimentais consistiram de (1) revisão em bancos de dados bibliográficos e genéticos para definir regiões alvo potenciais para identificação específica dos sorotipos de Salmonella; (2) desenvolvimento de métodos de amplificação pela reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de sequenciamento de DNA; (3) validação desses métodos pela análise de 63 isolados de Salmonella de 21 sorotipos de ocorrência frequente em granjas de produção animal e alimentos do Sul do Brasil. Os resultados mostraram a identificação de duas regiões espaçadoras intergênicas (ISRs, intergenic spacers regions) localizadas nos operons rrnH e rrnB (síntese de RNAs transportadores/ribossomais). Os métodos de PCR-sequenciamento possibilitaram a amplificação e análise das ISRs de todos os 63 isolados. Amostras de mesmo sorotipo apresentaram sequências específicas em ambos ISRs, possibilitando a identificação dos sorotipos. A análise comparativa demonstrou 95,2% de concordância do método de análise de DNA em relação à sorotipagem. A análise conjunta das sequências aumentou o poder de discriminação, possibilitando inclusive a diferenciação de isolados de mesmo sorotipo (Typhimurium e Gallinarum). Em conclusão, esses resultados demonstram a eficiências dos métodos de PCR-sequenciamento das ISRs dos operons rrnH e rrnB na identificação de sorotipos de Salmonella.