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Entre as doenças infecciosas, a tuberculose (TB) é considerada uma das mais prevalentes ecom altas taxas de mortalidade. O panorama é ainda mais complicado pelo aumento das cepasde Mycobacterium tuberculosis resistentes aos principais fármacos utilizados no tratamentoanti-TB. O diagnóstico precoce e a identificação dos principais genes de resistência sãoconsiderados os fatores mais importantes para o controle da doença. O objetivo deste estudofoi padronizar e avaliar o uso da genotipagem por PCR em tempo real para identificar asprincipais mutações envolvidas na resistência à isoniazida - INH (katG 315 G/C e inhA -15C/T). Para a realização da PCR em tempo real foram analisadas 55 amostras de DNA extraídode cultura de M. tuberculosis resistente à INH, previamente caracterizadas porsequenciamento. A concordância entre os testes (PCR em tempo real versus sequenciamento)foi, para o alvo katG, o índice Kappa de 0,89. A sensibilidade e especificidade foram 97 e91%, respectivamente. Para inhA, o índice de Kappa foi de 0,91, a sensibilidade eespecificidade foram 94 e 97%, respectivamente. A análise da curva ROC mostrou a área soba curva (AUC) de 0,94 para katG e 0,96 para inhA (para ambas as avaliações, a AUCapresentou significância estatística de p <0,001). Concluiu-se que a genotipagem por PCR emtempo real é um bom método para identificar as principais mutações envolvidas na resistênciaà INH, assim como pode ser uma alternativa ao sequenciamento.